Pemeriksaan Protozoa dengan preparat awetan

Pemeriksaan tinja langsung (direct) dan pewarnaan permanen tinja dapat dilakukan untuk mengetahui adanya tropozoit dan kista dari protozoa. Terutama pewarnaan permanen digunakan untuk mengidentifikasi protozoa dan untuk melakukan konfirmasi hasi emeriksaan lain. Selain itu pewarnaan permanen digunakan pula untuk membuat media pembelajaran bagi mahasiswa. Pewarnaan permanen yang paling sering dipakai adalah pewarnaan menurut Heidenhain metode iron hematoxylin. Hasil pewarnaan dapat bertahan sampai beberapa tahun, apalagi bila pewarnaan dilakukan dengan cara lambat.

Heidenhain’s iron hematoxylin staining dapat digunakan untuk mewarnai spesimen yang baru maupun spesimen yang sebelumnya sudah diawetkan dengan bahan pengawet PVA, namun demikian jangan digunakan untuk mewarnai spesimen yang semula diawetkan dengan pengawet formalin maupun MIF karena akan terjadi warna yang kurang memuaskan.

Bahan-bahan yang diperlukan untuk membuat zat pewarnanya :

1.      Larutan Schaudinn

Alkohol 95% .....................................................................  1 bagian

Larutan jenuh HgCl₂ .........................................................  2 bagian

Campurkan alkohol dengan HgCl₂ jenuh dan kocok dengan seksama. Bila akan menggunakan larutan Schaudinn, tambahkan 5 ml asam asetat glacial pada 100 ml campuran di atas.

2.      Larutan Iodine alkohol

Masukkan Kristal iodine ke dalam 70% alkohol sampai diperoleh warna yang kehitaman. Sebelum digunakan tambahkan 70% alkohol pada larutan tadi sampai diperoleh warna yang menyerupai warna teh tua.

3.      Larutan Mordant ( kontras )

Ammonium Ferri Sulfat ( kristal violet ) ...........................  4 gram

Aquades ............................................................................  100 ml

Karena Kristal violet berbongkah, sebaiknya digerus terlebih dahulu sebelum dilarutkan agar kelarutannya cepat. Larutan ini harus disimpan di lemari es.

4.      Stock Hematoxylin ( 10% )

Kristal Hematoxylin ..........................................................  10 gram

Alkohol 96% .....................................................................  100 ml

Terlebih dahulu larutkan hematoxylin dalam sedikit alkohol, baru kemudian tambahkan sisa alkohol yang ada. Biarkan larutan ini menjadi tua dengan menyimpannya selama 6 minggu sebelum dapat digunakan. Untuk membuat larutan zat warna Hematoxylin, maka larutkan 5 ml stock hematoxylin yang telah tua dalam 95 ml aquades. Larutan ini tidak stabil, oleh karena itu harus dibuat hanya pada saat akan digunakan saja.

5.      Larutan peluntur

a.      Larutan Ferric alum (2%)

Encerkan larutan mordan (kontras) dengan aquades dalm perbandingan 1:1. Larytan sebaiknya ibuat saat akan digunakan.

b.      Larutan jenuh asam pikrat

Larutkan 2 gram asam pikrat di dalam 100 ml aquades. Kocok dengan seksama dan biarkan selama beberapa hari dan dikocok sesekali selama pendiaman. Setelah semua asam pikrat terlarut dan tertinggal beberapa bagian yang tak terlarut, lakukan penyaringan. Larutan ini sangat stabil pada penyimpanan yang lama.

6.      Carbol Xylene ( 1:3 )

Untuk membuat larutan ini ditambahkan 1 bagian phenol cair ke dalam 3 bagian xylene. Phenol Kristal dapat dicairkan dengan cara memanaskan di dalam penangas air (waterbath). Larutan ini sangat stabil dalam penyimpanan yang lama.

7.      Larutan jenuh Lithium Carbonat

Larutkan serbuk lithium carbonat ke dalam aquades sampai tidak dapat terlarut lagi (biasanya 1-2 gram lithium carbonat dalam 100 ml aquades). Simpan larutan ini dan akan tahan dalam waktu yang lama.

            Teknik pewarnaan dengan larutan iron hematoxylin di atas ada 2 cara, yaitu cara cepat dan lambat. Cara lambat memberikan hasil yang lebih baik daripada cara cepat. Langkah-langkah yang dilakukan agar memperoleh hasil yang memuaskan adalah :

1.      Oleskan spesimen tinja pada objek glass (slide) yang bersih. Jika perlu, encerkan spesimen dengan garam fisiologis (NaCl 0,9%)

2.      Segera masukkan spesimen yang telah dioleskan tadi ke dalam larutan Schaudinn. Untuk mewarnai spesimen yang segar (bukan awetan) sangat dianjurkan bahwa spesimen yang tela dioleskan pada objek glass tidak dibiarkan menjadi kering. Mulai dari saat dioleskan sampai selesai pewarnaan, jangan sekali-kali spesimen dibiarkan kering. Hal ini sangat kritis dan perlu diperhatikan dengan seksama.

Apabila terpaksa harus menunda pewarnaan, maka simpan spesimen tadi dalam alkohol 70%.

3.      Selanjutnya lakukan sebagai berikut :

Kegiatan	Cara cepat	Cara lambat
Larutan Schaudinn	5 menit, 50oC	60 menit di suhu kamar
50% alkohol	3 menit di suhu kamar	3 menit di suhu kamar
Iodine alkohol	5 menit di suhu kamar	3 menit di suhu kamar
50% alkohol	3 menit di suhu kamar	3 menit di suhu kamar
Air	3 menit di suhu kamar	3 menit di suhu kamar
Mordant	10-20 menit 50oC	12-24 jam suhu kamar
Air 2 kali ganti	3 menit (total)	3 menit (total)
0,5% hematoxylin	5-10 menit 50oC	12-24 jam suhu kamar
Larutan peluntur Ferric alum Atau Asam pikrat	1-3 menit 5-10 menit Sebaiknya dicek di mikroskop	1-3 menit 5-10 menit Sebaiknya dicek di mikroskop
Air mengalir	5-30 menit	5-30 menit
Lithium carbonat	3 menit	3 menit
95% alkohol	5 menit	5 menit
Carbol Xylene	5 menit	5 menit
Xylene	3 menit	3 menit
Beri perekat permount atau sejenisnya dan tutup dengan cover (deck) glass

            Saat yang paling kritis saat pewarnaan ini adalah saat mencuci dengan larutan peluntur. Setiap ½ menit, 1 menit, dan 2 menit sekali spesimen harus diangkat dari larutan peluntur dan dibilas dengan air bersih untuk memperlambat proses pelunturan atau menghentikannya serta di cek di bawah mikroskop. Proses pelunturan dianggap selesai bila pada pemeriksaan di bawah mikroskop struktur parasit terlihat dengan jelas secara detil, misalnya nukleusnya.

            Apabila pada pemeriksaan di bawah mikroskop parasit sulit ditemukan, pelunturan dianggap selesai bila latar belakang pewarnaan menjadi berwarna lebih kelabu. Karena asam pikrat bekerja lebih lambat daripada ferric alum, maka pelunturan dengan asam pikrat lebih mudah dikontrol.

Tropozoit Entamoeba histolytica

Tropozoit Entamoeba coli

Giardia lamblia, kiri: kista, kanan: tropozoit

Kista Balantidium coli